植物是生物活性化合物的天然宝库。国外学者Wilkins和Board曾经报道，有1 389种植物可以作为杀菌剂、防腐剂的提取来源[1]，约2 400种植物具有控制有害生物活性的作用[2]，而植物产生的次生代谢产物超过400 000种[3]，其中多数化合物如多酚、黄酮、生物碱、萜烯类和有机酸类均具有抗菌性或杀虫活性。然而，目前研究开发的植物种类仅仅占比10%，大量潜在的具有活性的植物种类或材料亟待开发利用。

牡丹（Paeonia suffruticosa Andr.）为芍药科（Paeoniaceae）芍药属（Paeonia）牡丹组落叶灌木，原产中国，是我国十大名花之首，素有“百花之王，国色天香”的美誉，历来为世人所喜爱。牡丹全身都是宝，其根、皮、花、叶、种子均可被利用[4]。2011 年，国家卫生部批准凤丹（Paeonia ostii T.Hong et ）牡丹和紫斑（Paeonia rockii T.Hong et J.J.Li et D.Y.Hong）牡丹籽油作为新资源食品。牡丹籽油含有丰富的不饱和脂肪酸，具有重要的保健价值和药用价值[5]。油用牡丹作为新兴木本油料作物，已被列入国家林业“十三五”发展规划重点林业工程，截至2016年，全国已发展到6.67万hm2以上。

油用牡丹果实是蓇葖果，一般每个蓇葖果有3～5个果荚，成熟的牡丹果荚外壳比较致密坚硬。牡丹种荚作为油用牡丹的副产品，随着油用牡丹种植规模的扩大，其产量逐步增加。根据测算，每生产100 kg牡丹籽会产出50～60 kg种荚。然而，在生产过程中大量的牡丹种荚被废弃，造成了资源浪费。

为了变废为宝，开展了种荚的综合利用。本研究以油用牡丹凤丹种荚为原料，研究其提取物的抗菌活性，探讨其作为食品防腐剂的可能性，以期为凤丹种荚资源的综合利用提供依据[6-7]。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试油用牡丹凤丹果荚采自国家牡丹基因库油用牡丹圃，系自育的八年生凤丹，8月上旬蓇葖果开裂后采收，果荚内种子脱离后外壳用于提取和抗菌试验[8-9]。

试验菌种为大肠杆菌 Escherichia coli（CCAM0）、金黄色葡萄球菌 Staphyloccocus aureus（CCAM0）、枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis（CMCC）、黑曲霉 Aspergillus niger（CCAM0）。

1.2 仪器与试剂

供试仪器：MP电子天平（上海恒平科学仪器有限公司生产）；LDZX-50FB立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂生产）；SA-JZ多功能超净工作台（上海稼丰园艺用品有限公司生产）；QTSXR超声波清洗仪（天津市瑞普电子仪器公司生产）；PGX-280A-22H型生化培养箱（宁波莱福科技有限公司生产）。

供试试剂：盐酸四环素、蛋白胨、琼脂（Sigma）；二甲基亚砜DMSO、氯化钠以及蔗糖（上海浩洋生物科技有限公司生产）。

1.3 凤丹种荚粗提物制备

将凤丹种荚漂洗之后自然晾干剪碎，于60℃恒温箱中烘干至恒重，用中药粉碎机粉碎后过20目筛，准确称取粉末40 g，平均分成2份。一份加入5倍体积的蒸馏水浸提24 h，并每隔2～3 h搅拌混匀1次，浸提之后过滤2次，上清液于8 000 r/min离心15 min，去除沉淀并浓缩，灭菌后4℃保存备用；另外一份以乙醇作为提取溶剂，滤渣重复提取2次，合并滤液，减压旋转蒸发溶剂，浓缩后冻干12 h，得乙醇粗提物[10-11]。

1.4 提取物样品的制备

称取预先干燥后的凤丹种荚醇提物和水提物，称定后分别用5%DMSO溶解配制成8 mg/mL溶液备用，并且在每次取用前均用超声充分分散均匀。

1.5 菌悬液及孢子悬液的配制

将各细菌菌种接种于LB固体培养基上，在37℃传代培养2次进行活化，挑取活化好的细菌用无菌生理盐水配制成菌悬液，按10倍浓度梯度进行稀释后进行平板菌落计数，计算出原菌悬液的浓度并在此基础上稀释成1×108CFU/mL菌悬液备用；真菌采用PDA培养基培养至产生大量孢子，再用无菌生理盐水将菌丝上的孢子洗脱后配制成菌悬液，用血球计数板计数，并稀释成1×106个/mL孢子悬液备用[12-13]。

1.6 抗细菌活性的测定

1.6.1 最小抑菌浓度（MIC）的测定。取各个极性部位提取物溶液100 μL采用2倍稀释法用无菌水稀释成一系列浓度梯度。取1 mL的1×108CFU/mL各细菌菌悬液加入至9 mL的LB液体培养基中混匀得相应的培养基菌悬液，在每管中分别加入100 μL培养基菌悬液，各管中提取物质量浓度依次为 2.000 00、1.000 00、0.500 00、0.250 00、0.125 00、0.062 50、0.031 25 mg/mL，以无菌水为空白对照，置于37℃的恒温培养箱中培养24 h后观察，以目视无菌生长的孔对应最低浓度为最小抑菌浓度。

1.6.2 牛津杯法测定对细菌抑制活性。取制备好的细菌悬液100 μL，加入到含LB固体培养基的平皿表面，用涂布棒涂布均匀。等距放上4个灭菌的牛津杯（10.0 mm×7.8 mm×6.0 mm）于含菌平板上，分别加入样液 100 μL，以 50 μg/mL盐酸四环素为阳性对照将平板置于37℃恒温箱培养，测量抑菌圈直径的大小，其中枯草芽孢杆菌培养18 h、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌培养24 h后测量结果。每个提取物平行做3个重复。

文章来源：《牡丹》 网址: http://www.mdzzs.cn/qikandaodu/2021/0415/1696.html