大黄史载于《神农本草经》，味苦性寒，在不少经方中常用作君药，也是临床广泛应用的中药材之一。大黄的主要功效为泻下、泻火、清热解毒、活血祛瘀、利水等[1]。大黄的5种不同方向的功效作用除了与治疗疾病症候的不同产生差异外，与大黄的配伍作用关系密不可分。大黄与不同的药味进行配伍后，药效物质基础和化学成分发生改变，从而使大黄产生不同方向的功用[2-4]。其中，基于清热解毒、化滞通便、热毒下泄[5-6]的作用，大黄配伍方药在临床中常用于治疗热毒疮疡、湿热瘀滞、火热内盛、咽喉肿痛、目赤肿痛等，如大黄牡丹汤、牛黄解毒片。对应于现代药效研究，清热解毒功效一般具有抗病毒、抗肿瘤、抗炎等作用[7]。笔者选取大黄经典组方中5种功效药对：大黄枳实、大黄黄连、大黄牡丹、大黄桃仁及大黄甘遂分别进行急性毒性研究，从大黄抗炎药效角度及其毒性的影响，横向比较分析大黄进行配伍后药效的变化差异，为临床安全、有效、合理用药提供实验依据。 1　材料与方法 1.1　实验动物　昆明种小鼠，体质量18～22 g，无特定病原体(SPF)级，由广西医科大学实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK(桂)2009-0002。使用许可证号XYXK(桂)2014-003，小鼠分笼饲养，保持正常昼夜循环。 1.2　药物与试剂　中药生大黄(甘肃，批号：)、枳实(江西，批号：)、黄连(四川，批号：)、牡丹皮(安徽，批号：)、桃仁(河北，批号：)、醋甘遂(陕西，批号：)。生大黄、牡丹皮及醋甘遂购于广西万宝堂药业有限公司，枳实、黄连及桃仁购于广州至信中药饮片有限公司，均由广西中医药大学药用植物教研室李斌副教授鉴定，大黄为蓼科植物药用大黄(Rheum officinale Baill.)的根茎，枳实为芸香科植物酸橙(Citrus aurantium L.)的干燥幼果，黄连为毛茛科植物黄连(Coptis chinensis Franch.)的干燥根茎，牡丹皮为毛茛科植物牡丹(Paeonia suffruticosa Andr.)干燥根皮，桃仁为蔷薇科植物桃(Prunus persica L. Batsch. )的干燥成熟果子，醋甘遂为大戟科植物甘遂(Euphorbia kansui T.N.Liou ex T.P.Wang )的干燥块根。醋酸地塞米松片(天津药业集团新郑股份有限公司，批号：，规格0.75 mg)，角叉菜胶(Sigma公司，批号：SLBH9868V)，一氧化氮(NO)试剂盒(批号：)、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(批号：)、丙二醇(MDA)试剂盒(批号：)均由南京建成生物工程研究所提供。实验用水为自制纯化水。 1.3　仪器　SQP型电子分析天平(天津泰斯特仪器有限公司，感量：0.1 mg)，EPOCH BIOTEK型全波长酶标仪(美国BioTek公司)，X1R型高性能通用台式离心机(美国赛默飞公司)。 1.4　方法 1.4.1　药物制备　大黄用10倍量水浸泡30 min后加热至微沸，控制微沸状态继续煎煮20 min，滤布过滤，浓缩成浸膏，即得大黄水提液供试品；5个药对大黄枳实、大黄黄连、大黄牡丹、大黄桃仁、大黄甘遂分别按大承气汤、泻心汤、大黄牡丹汤、桃核承气汤和大陷胸汤中的1：1，1：1.5，1：0.25，1：1，1：0.1的药物剂量比例加10倍量水先浸泡30 min后加热至微沸，控制微沸状态继续煎煮20 min，滤布滤过，浓缩成浸膏，即得各药对水提液供试品[8]，浓度依次为0.283，0.310，0.488，0.403，0.485，0.350 g·mL-1 1.4.2　角叉菜胶致小鼠足肿胀实验　小鼠140只，雄性，按体质量分层随机分为14组，每组10只，分别为大黄、大黄枳实、大黄黄连、大黄牡丹、大黄桃仁和大黄甘遂大、小剂量组(30，15 g·kg-1)，地塞米松(0.01 g·kg-1)组，模型对照组(0.9%氯化钠溶液，等容积)。每天灌胃给药2次，灌胃剂量20 mL·kg-1，连续7 d。实验前12 h禁食不禁水。末次给药后1 h，每只小鼠右后侧足趾皮下注射1%角叉菜胶0.05 mL，4 h后进行小鼠眼球取血，3 000 r·min-1(r=12 cm)低温离心15 min，取血清-20 ℃保存待测。取血后处死小鼠，于踝关节处剪下左右后足，称质量，计算肿胀度及肿胀抑制率，计算公式如下式： 肿胀度(mg)=致炎足质量(mg)-正常足质量(mg) 抑制率(%)=(模型对照组肿胀度均值-给药组肿胀度均值)/模型对照组肿胀度均值×100%[9]。 取待测血清，分别按NO试剂盒、SOD试剂盒、MDA试剂盒说明书操作方法测定MDA和NO含量及SOD活性。 1.4.3　急性毒性实验　预实验：取小鼠56只，雌雄各半，体质量18～22 g，实验前小鼠禁食不禁水12 h，按体质量分层随机分为7组：大黄组、大黄枳实组、大黄黄连组、大黄牡丹组、大黄桃仁组、大黄甘遂组和正常对照组，每组8只。给药组分别按可供灌胃最大浓度所含的生药量大黄48.44 g·kg-1、大黄枳实47.43 g·kg-1、大黄黄连39.18 g·kg-1、大黄牡丹34.48 g·kg-1、大黄桃仁37.70 g·kg-1和大黄甘遂60.79 g·kg-1及小鼠灌胃可承受的最大体积0.04 mL·g-1进行一次性灌胃给药，正常对照组给予等体积0.9%氯化钠溶液。给药后各组小鼠进行常规饲养，观察3 d。 正式实验：小鼠84只，雌雄各半，按体质量分层随机分为大黄组、大黄枳实组、大黄黄连组、大黄牡丹组、大黄桃仁组、大黄甘遂组及正常对照组，每组12只。实验前禁食不禁水12 h，各给药组按预实验小鼠可供灌胃最大浓度所含的生药量及小鼠灌胃可承受的最大体积进行给药，正常对照组给予等体积0.9%氯化钠溶液，1 d内连续3次，每次间隔6 h，间隔期间禁食，即累计灌胃剂量分别为大黄145.33 g·kg-1、大黄枳实142.30 g·kg-1、大黄黄连117.53 g·kg-1、大黄牡丹103.45 g·kg-1、大黄桃仁113.09 g·kg-1及大黄甘遂182.36 g·kg-1。给药后进行常规饲养，连续观察14 d。 1.4.4　统计学方法　使用SPSS 19.0版统计学软件进行数据处理，计量资料以均数±标准差±s)表示，多组间均数比较用单因素方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。 2　结果 2.1　大黄及其5个药对提取物对角叉菜胶所致足肿胀的影响　与模型对照组比较，大黄及其5个药对提取物大、小剂量组及地塞米松组对角叉菜胶致小鼠足肿胀均有抑制作用，差异有统计学意义(F=6.19，P<0.05)；与地塞米松组比较，大黄甘遂大、小剂量组均差异无统计学意义(P>0.05)，其余各给药大、小剂量组差异有统计学意义(F=7.54，P<0.05)，表明大黄甘遂对角叉菜胶致小鼠足肿胀抑制作用与地塞米松差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。 Tab.1　Comparison of paw swelling among eight groups of mice±s，n=10组别足肿胀度/mg抑制率/%模型对照组55.-地塞米松组17.*161.81大黄组 30g·kg-134.*1*223.93 15g·kg-133.*1*224.62大黄枳实组 30g·kg-135.*1*221.36 15g·kg-137.*1*216.36大黄黄连组 30g·kg-122.*1*249.71 15g·kg-131.*1*229.64大黄牡丹组 30g·kg-127.*1*238.67 15g·kg-136.*1*218.21大黄桃仁组 30g·kg-135.*1*221.80 15g·kg-140.*1*210.26大黄甘遂组 30g·kg-114.*167.58 15g·kg-116.*163.39 2.2　大黄及其5个药对提取物对角叉菜胶致小鼠足肿胀、MDA含量及SOD活性的影响　与模型对照组比较，大黄及其5个药对提取物大、小剂量组及地塞米松组致炎小鼠中炎症组织NO及MDA含量均降低，SOD活力均上升(P<0.05)，见表2。 Tab.2　Comparison of the content of NO and MDA and the activity of SOD among eight groups of mice±s，n=10组别NO/(μmol·mL-1)MDA/(nmol·mL-1)SOD/(U·mL-1)模型对照组13.地塞米松组6.*15.*194.*1大黄组 30g·kg-16.*14.*1116.*1 15g·kg-14.*15.*1106.*1大黄枳实组 30g·kg-14.*15.*1110.*1 15g·kg-16.*16.*1大黄黄连组 30g·kg-13.*13.*1112.*1 15g·kg-14.*14.*1119.*1大黄牡丹组 30g·kg-15.*15.*1118.*1 15g·kg-15.*14.*1112.*1大黄桃仁组 30g·kg-16.*15.*1101.*1 15g·kg-15.*14.*1112.*1大黄甘遂组 30g·kg-15.*13.*1115.*1 15g·kg-14.*15.*1105.*1 2.3　大黄及其5个药对提取物对小鼠的急性毒性　小鼠灌胃给药后，多数出现活动明显减少，闭眼抱团，怠动安静等症状。第2天，小鼠精神状态及活动情况基本恢复正常，进食量及体质量也逐步恢复正常。连续观察14 d，均无小鼠死亡，无法测出各组的半数致死量[10]，且体质量变化及进食量与正常对照组比较，均无异常变化。见表3及图1。结果表明，大黄及其5个药对提取物配伍后毒性较小，在一定范围内基本安全。大黄、大黄枳实、大黄黄连、大黄牡丹、大黄桃仁及大黄甘遂组小鼠灌胃最大耐受量分别为145.33，142.30，117.53，103.45，113.09，182.36 g·kg-1，相当于人临床日用量(0.25 g·kg-1)的581，569，470，418，452及729倍。 Tab.3　Acute toxicity symptom in seven groups of micen=12组别怠动只数发生时间/h抱团只数发生时间/h闭眼只数发生时间/h正常对照组0-0-0-大黄组80.25～.25～.25～8大黄枳实组60.25～860.25～8100.25～8大黄黄连组50.25～2470.25～890.25～8大黄牡丹组10.25～460.25～890.25～8大黄桃仁组20.25～470.25～880.25～8大黄甘遂组60.25～4870.25～.25～24 图1　7组小鼠在急性毒性实验中的体质量变化 3　讨论 炎症的发生是具有血管系统的活体组织在致炎因素的作用下，由炎症递质参与引起的一系列病理生理过程，是机体的特异性防御反应[11]。本实验建立的角叉菜胶致炎模型主要是以机体毛细血管扩张、通透性增加导致炎症因子渗出和肿胀的早期反应。NO作为一种炎症递质，能引起组织损伤。炎症发生过程中同时伴有大量氧自由基的生成，如醛基，测定炎症组织中醛基的量常可反映机体内脂质过氧化的程度。醛基的测定常与SOD的测定相结合，SOD可间接反映机体清除氧自由基的能力，醛基则间接反映了机体细胞受自由基攻击的损伤程度。 本实验研究结果显示，大黄及其5个药对提取物大、小剂量组均能抑制角叉菜胶致小鼠足肿胀，表现出抗炎作用；并可降低小鼠炎症组织MDA和NO含量，提高SOD活力。从横向角度看，单味药大黄经过与不同味药配伍后，各药对表现出的药效略有不同。大黄能清热解毒，其中蒽醌类成分大黄酸通过抑制炎症因子NO的生成而发挥主要的抗炎作用[12-14]。传统用法以大黄牡丹汤为经典代表方剂，与桃仁、牡丹皮配伍，具有增强免疫调节、抑制炎症递质产生的作用[12]。但本实验仅以大黄与5个单味药组成不同的药对进行药效实验，抗炎作用在表观上与地塞米松组比较，大黄甘遂组药效最优。甘遂作为配伍环境因素，可影响大黄在复方中功效的发挥[15]。甘遂中存在一种化合物cynandione A，对激活的中性粒细胞和肥大细胞具有抑制作用从而产生良好的抗炎作用[16]，这是否说明，大黄甘遂药对经过配伍后其配伍环境的改变及甘遂自身具有的抗炎组分使得大黄甘遂组抗炎药效最优，还有待进一步研究；其次为大黄黄连组和大黄牡丹组。黄连的主要化学成分小檗碱对角叉菜胶引起的渗出性炎症具有抑制作用[17]，本实验结果表明，大黄黄连组与大黄甘遂组比较，其对足肿胀度的抑制作用差异有统计学意义(P<0.05)，这从另一个角度提示黄连的碱性成分和甘遂的萜类化合物与大黄配伍后在一定程度上都有助溶作用，从而使大黄甘遂组与大黄黄连组在本实验中表现出较好的药效作用。虽然大黄牡丹汤是用于清热解毒的经典方剂，但在本次实验中选用的大黄牡丹药对提取物对小鼠足肿胀度的抑制作用并不是最强，这可能是在经典方中大黄牡丹作为君药，其他佐使组方如芒硝、桃仁和冬瓜仁的存在有助于有效成分丹皮酚和结合蒽醌的煎出量增加从而表现出良好的抗炎作用[18]。牡丹皮的活性成分丹皮总苷具有抗炎及双向免疫调节作用，其对模型大鼠的继发性炎症治疗作用与其对此模型大鼠异常的细胞免疫功能有关，这一功能关联性对牡丹发挥药效作用是否有影响有待进一步探讨。另外，本次实验中大黄5个药对提取物对小鼠足肿胀度抑制率最低的是大黄桃仁组，桃仁的主要化学成分是脂溶性成分[19]，虽然有研究报道桃仁水提物具有一定的抗炎作用，但其起药效作用的成分是桃仁多糖[20]，这可能是因其抗炎药效成分含量较低而导致大黄桃仁组抗炎药效比其他各组较低，传统上大黄桃仁药对并不用于抗炎治疗，也许是由于其疗效并非最优。另一方面，实验测得大黄及其5个配伍药对提取物对降低致炎小鼠血清NO和MDA含量，提高其SOD活力的能力在表观上相差不大。这是否提示大黄与5个味药配伍后发挥抗炎功效的物质基础相同或是在一定程度上成分有所重叠，还有待进一步研究。 中药复方配伍的目的之一就是提高疗效、降低毒副作用。本实验通过研究大黄与5个药味配伍后对小鼠急性毒性影响，结果表明，按最大给药量及可承受最大体积进行灌胃，连续观察14 d，各组小鼠均无死亡，在一定程度上说明大黄与各药对配伍后在该剂量下安全低毒。另外，从实验表观观察结果可看出，5个药对配伍组小鼠怠动、抱团和闭眼等症状都比大黄组的发生率低且持续时间相对更短； 5个药对给药组小鼠体质量变化趋势与正常对照组相对保持一致，而大黄组虽然也稳步增长，但其体质量比其他各组均低，这在一定程度上提示大黄经过配伍后毒副作用有所降低。说明药对在中药复方配伍中显得尤为重要，中药进行配伍后其化学成分、物质基础及药效作用也会发生相应变化[21-22]，但其具体的药效物质基础及作用机制还需进一步研究。

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